(приостановлено производство) Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G6P-DH)

Кинетическое определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в сыворотке, плазме и эритроцитах.

КОЛИЧЕСТВО в наборе: N по каталогу 17005D дигитонин 6 x 20 мл (для определения Г6Ф-ДГ в эрит­роцитах, используется только с набором 17005)

НАЗНАЧЕНИЕ

Дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6Ф-ДГ) наиболее распространенное заболевание, обуслов­ленное ферментативной патологией. Дефицит фермента является генетическим рецессивным признаком, связанным с Х хромосомой. Эта патология может являться причиной повышенной деструкции эритроцитов и даже анемии.

МЕТОД                    

Активность Г6Ф-ДГ в пробе определяется по степени увеличения абсорбции при 340 нм в результате пре­вращении НАДФ⁺ по следующей реакции:

Г6Ф-ДГ

Г-6-Ф + NADP+ глюконат-6-Р + NADPH + H+

ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ

Реагент 1 : готов к применению. В нераспечатанном флаконе реагент стабилен вплоть до указанной даты при хранении 2...8°С. После вскрытия реагент сохраняет стабильность в течение 120 дней при 2...8°С. Раствор R2: добавьте 2 мл дистиллированной воды во флакон с реагентом 2. Оставьте стоять на 1 0 ми­нут, затем осторожно перемешайте. Полученный раствор стабилен 30 дней при 2...8°С. Раствор R3: добавьте 2 мл дистиллированной воды во флакон с реагентом 3. Оставьте стоять на 1 0 ми­нут, затем осторожно перемешайте. Полученный раствор стабилен 30 дней при 2...8°С. Реагент 4: готов к применению. В нераспечатанном флаконе реагент стабилен вплоть до указанной даты при хранении 2...8°С. После вскрытия реагент сохраняет стабильность в течение 120 дней при 2...8°С. Стабильность реагентов и растворов обеспечивается при отсутствии загрязнения. Флаконы закрывайте крышками сразу после использования.

ПРОБЫ

Свежая сыворотка, плазма и эритроциты. Не допускайте гемолиза. Стабильность: 8 часов при 2...8°С.

УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЯ

Длина волны 340 (334-365) нм

Оптический путь 1 см

Температура  25-30-37°С

Измерение: кинетическое, реакция с увеличением оптической плотности

СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ (сыворотка и плазма)

Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до температуры измерения . Температура должна быть стабильной (+/- 0,5°С) в течение всего определения.

 

Добавить в термостатированную кювету (мкл)	25-30°С	37°С
Реагент 1	1000	1000
Раствор R2	50	50
Проба (сыворотка/плазма)	500	250
Тщательно перемешать, инкубировать 10 минут при выбранной температуре.
Раствор R3	25	25

Тщательно перемешать, измерить начальную оптическую плотность и одновременно запустить секундомер. Измерить оптическую плотность опытной пробы ровно через 1 , 2 и 3 минуты.

СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ (эритроциты)

Подготовка эритроцитов для анализа

Определите содержание эритроцитов в цельной крови.

Добавьте к 0,2 мл цельной крови 2 мл 0,9 % раствора NaCl. Центрифугируйте полученную суспензию 10 мин при 3000 об/мин. Слейте супернатант, добавьте к осадку эритроцитов 2 мл 0,9 % раствора NaCl, вновь центрифугируйте. Процесс отмывки повторите 3 раза. К осадку отмытых эритроцитов добавьте 0,5 мл реа­гента 4 и оставьте на 15 мин при 2...8°С, вновь центрифугируйте. Для анализа используется супернатант (гемолизат эритроцитов) в количестве 1 5 мкл. Исследование активности Г6Ф-ДГ должно быть выполнено не позднее чем через 2 часа.

Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до 25°С. Температура должна быть стабильной (+/- 0,5°С) в течение всего определения.

 

Добавить в термостатированную кювету (мкл) 25°С

Реагент 1  - 1000

Раствор R2 - 30

Проба ( гемолизат) - 15

Тщательно перемешать, инкубировать 5 минут при 25°С.

Раствор R3 - 15

Тщательно перемешать, измерить начальную оптическую плотность и одновременно запустить секундомер. Измерить оптическую плотность опытной пробы ровно через 1 , 2 и 3 минуты.

ВЫЧИСЛЕНИЕ

Вычислить среднее изменение оптической плотности за 1 минуту (АА/мин). Для расчета активности Г6Ф-ДГ в пробе полученное значение АА/мин умножьте на следующий фактор:

Активность Г6Ф-ДГ в сыворотке и плазме:

Длина волны	334 нм	340 нм	365 нм
Е/л (25/30°С) АА/мин	510	500	900
Е/л     (37°С) АА/мин	858	841	1514
Активность Г6Ф-ДГ в эритроцитах:
Длина волны	334 нм	340 нм	365 нм
мЕ в эритроцитах/мл крови х	34304	33650	60571

Расчет активности Г6Ф-ДГ на 1 0⁹ эритроцитов используется для сопоставления результатов, полученных для проб с различным содержанием эритроцитов в 1 мл цельной крови. (Например, если содержание эрит­роцитов в цельной крови составляет 5,3 х 10⁹/мл, полученную активность следует разделить на 5,3).

ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЙ

Линейность метода: если среднее изменение оптической плотности за минуту (АА/мин) превысит 0,030 (при 365 нм) или 0,060 (при 334/340 нм) добавьте к 0,2 мл пробы 1 ,8 мл физиологического раствора (0,9 %), по­вторите измерение, а полученный результат умножьте на 10 (коэффициент разведения). 

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ

Сыворотка/плазма:       0 - 0,1 8 Ед/л (₉мЕ/мл)
Эритроциты:                        118 - 144 мЕ/10 эритроцитов

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА

Для проведения контроля качества рекомендуется использовать контрольные сыворотки с аттестованными для этого метода значениями Г6Ф-ДГ.

ПРИМЕЧАНИЯ

1 . Если активность Г6Ф-ДГ в пробе очень низкая, измерьте оптическую плотность точно через 5 минут по­сле добавления последнего реагента, а разницу между конечным и начальным измерением разделите на 5.

2.  Реагент 4 содержит азид натрия в качестве консерванта. Избегайте попадания реагента на кожу, слизи­стые оболочки и в рот. 

Информация для заказа

Область использования: Биохимические наборы	Производство:	Sentinel
	Метод:
	Объем:	2х50
	Кат. номер:	S/17005-
Цена (с НДС 10%):	по запросу	В корзину
Наименование: (приостановлено производство) Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G6P-DH) . Примечание: