Гелевая технология в серологии групп крови

I.M. Bromilow
Антенатальная лаборатория Регионального Трансфузиологического Центра, Ливерпуль

Опубликовано в журнале «Medical Laboratory Sciences», 1992, том 49, стр. 129-132
Опубликовано в журнале «Вестник службы крови России», № 1, январь 1998, с. 14-17.

Резюме:

Серологические исследования, основанные на реакции гемагглютинации, обычно проводятся в жидко-фазных системах. Гелевая технология предусматривает разделение эритроцитов путем центрифугирования в геле, при этом неагглютинированные эритроциты (отрицательный результат) проходят через гель и оседают на дне пробирок, в то время как агглютинированные эритроциты задерживаются на поверхности или в толще геля. Гель может быть нейтральным или содержать специфические реагенты, например антиглобулиновый реагент или специфические антисыворотки к эритроцитарным антигенам. Показано, что гелевая система является более чувствительной, чем традиционные серологические методики, особенно при определении и идентификации клинически значимых антител. Устранение этапа отмывания при проведении антиглобулинового теста и стабильность всех тестов обеспечивает высокий уровень достоверности результатов и улучшает возможность стандартизации и контроля лабораторных исследований.

Введение

С того времени, как Ландштейнер впервые продемонстрировал реакцию агглютинации эритроцитов и открыл систему АВО? было предложено много различных методик определения реакций антиген-антитело. В 1970-х годах количество и сложность предлагаемых технологий достигла своего пика, используемые методики позволяли выявить все антитела, присутствующие в исследуемых сыворотках. Позже стало очевидно, что многие из разработанных методик использовались необоснованно и что серологический скрининг должен включать в себя точное определение АВО и Rh-фенотипа, а также определение и идентификацию только клинически значимых антител с целью облегчить подбор крови для трансфузии и возможно более ранней диагностики гемолитической болезни новорожденных.

Рационализация лабораторных методик проводилась с целью поиска недорогой технологии, обеспечивающей значимые результаты и не требующей значительных временных затрат. В отношении скрининга и идентификации антител, а также определения совместимости крови это означает разработку методик обнаружения антител, вызывающих реакции гемолиза и агглютинации при 37ºС. Антитела, активные при более низких температурах не имеют клинического значения, и использование целого ряда сложных тестов для их обнаружения более не считается целесообразным.

Одним из наиболее важных условий получения корректных данных реакции агглютинации является оценка результата. Слабая реакция может быть неверно интерпретирована, особенно неопытным персоналом. Ложные, слабые или отрицательные результаты непрямого антиглобулинового теста могут иметь место за счет нейтрализации антиглобулинового реагента следами сыворотки вследствие недостаточно эффективного отмывания эритроцитов. Неадекватное перемешивание эритроцитов и элюция слабо фиксированных антител в процессе отмывания могут стать причиной ошибок при проведении непрямого антиглобулинового теста. Методики центрифугирования в геле были вначале разработаны с целью стандартизации реакции гемагглютинации для получения достоверных результатов. Оригинальная методика была основана на выделении эритроцитов из крови человека путем фильтрации через гель. Были исследованы несколько различных декстрановых гелей, для повышения достоверности получаемых данных использовались хроматографические методики. Принципиально пригодными для серологических исследований были признаны гели SephadexTMG1006 superfine и Sephadex TM G200 superfine. Для рутинного использования гель должен быть приготовлен в условиях строгой стерильности с выполнением всех необходимых технологических требования, для обеспечения его высокого качества и совместимости с эритроцитами крови человека. Приготовленный гель может быть нейтральным, с добавлением специфических антисывороток или антиглобулинового реагента. После заполнения гелевого матрикса сыворотки должны быть протестированы на стабильность в гелевой среде, а также проведен обычный контроль качества на специфичность, силу реакции и т.д.

Центрифугирование в геле может быть конечной фазой любых серологических исследований, основанных на реакции гемагглютинации, кроме методов, требующих диспергирования для оценки результата. В настоящее время фирма DiaMed выпускает патентованную и зарегистрированную систему для проведения гелевого теста. ID-система представляет собой пластиковые карты, содержащие по шесть микропробирок, заполненных гелем. Диапазон выполняемых тестов включает в себя определение фенотипа эритроцитов, антиглобулиновый тест, скрининг и идентификацию антител и тесты на совместимость.

Принцип гелевого теста

Забуферный декстрановый гель может быть использован как нейтральный или содержащий специфические антисыворотки или антиглобулиновый реагент на гелевом матриксе.

На гель наносятся эритроциты или смесь эритроцитов и сыворотки. Клетки всегда вносятся перед сыворотками - в отличие от стандартных серологических методик - с тем, чтобы тестируемые сыворотки не контактировали с гелем, что особенно важно при проведении антиглобулинового теста. После инкубации следует центрифугирование в строго определенном режиме - 70 g x 10 минут, центробежная сила направлена вдоль геля. Если условия центрифугирования не выполняются (центрифугирование недостаточно длительное или слишком мягкое) могут иметь место ложноположительные результаты. Ложноотрицательные результаты также могут иметь место при нарушении условий центрифугирования.

В ходе центрифугирования эритроциты отделяются от суспензирующей среды или сыворотки и либо остаются на поверхности геля или задерживаются в толще геля, если имеет место агглютинация. Если агглютинация отсутствует, эритроциты проходят через гель и образуют осадок на дне микропробирки. Использование метода центрифугирования в геле позволяет избежать отмывания эритроцитов при проведении непрямого антиглобулинового теста.

Количественная оценка агглютинации производится по распределению эритроцитов в гелевом матриксе.

Применение метода центрифугирования в геле при определении групп крови

ABO и Rh-фенотипирование

Микропробирки содержат смесь геля и специфических антисывороток, при помощи, которых может быть установлен АВО и Rh-фенотип. Эритроциты предварительно суспендируются в растворе фермента бромелина до концентрации 5%. После короткой инкубации при комнатной температуре по 10 мкл суспензии раскапывается по микропробиркам соответствующей гелевой карты. Затем следует центрифугирование, в ходе которого происходит контакт эритроцитов с сыворотками. При наличии на эритроцитах соответствующего антигена происходит реакция гемагглютинации, при его отсутствии - эритроциты проходят через гель и оседают на дне микропробирки. Обратная реакция проводится в нейтральном геле с помощью стандартных эритроцитов, не подвергавшихся обработке ферментом.

Смешанные популяции клеток часто затрудняют диагностику, особенно если одна из популяций представлена лишь небольшим процентом клеток. Существует много возможных причин возникновения смешанных популяций эритроцитов и очень важно правильно интерпретировать этот тип агглютинации, например при подозрении на трансплацентарные геморрагии, после трансплантации костного мозга, после трансфузий крови, при изучении определенных подгрупп антигенов А и В, когда подозревается химеризм. При проведении гелевого теста разнородные клеточные популяции отчетливо разделяются на положительные и отрицательные результаты реакции, тем самым значительно упрощая чтение реакции. Гелевый тест способен определять клеточные популяции, состоящие из 1% клеток.

Другие виды фенотипирования могут выполняться либо с использованием нейтрального геля либо с использованием геля, содержащего антиглобулиновый реагент или сыворотки к различным эритроцитарным антигенам.

Скрининг и идентификация антител

Скрининг антител выполняется как в нейтральном геле, так и в геле, содержащем антиглобулиновый реагент. В первом случае для исследования используются папаинизированные эритроциты, во втором - суспензия эритроцитов в растворе низкой ионной силы. После внесения исследуемой сыворотки следует 15-минутная инкубация при 37ºС, затем после центрифугирования читаются и интерпретируются результаты. При проведении непрямого антиглобулинового теста не требуется отмывания эритроцитов, поскольку отсутствует контакт сыворотки с гелем и, поэтому нет потенциальной возможности нейтрализации антиглобулинового реагента. Скрининг и идентификация антител производится с помощью стандартных панелей эритроцитов.

При оценке эффективности гелевого теста для скрининга и идентификации антител была установлена его более высокая чувствительность по сравнению с традиционными методиками. Это увеличение чувствительности обусловлено несколькими причинами. При использовании 0,8% суспензии эритроцитов соотношение сыворотка/клетки возрастает. Реакция происходит в растворе низкой ионной силы, что увеличивает чувствительность метода. Отсутствие этапа отмывания приводит к снижению процента ложноотрицательных или слабых реакций, обусловленных нейтрализацией антиглобулинового реагента следами сыворотки.

Преимуществом гелевого теста без отмывания эритроцитов является также то, что нет необходимости перепроверки отрицательных результатов с сенсибилизированными эритроцитами для контроля. Отсутствие этапа отмывания ведет также к увеличению чувствительности теста и снижению риска элюции слабо фиксированных антител с мембраны эритроцитов в процессе отмывания. Еще одни несомненным преимуществом гелевого теста является сокращение времени на проведение исследования.

Было обнаружено, что гелевая методика позволяет выявить больший спектр клинически значимых антител со снижением количества ложноотрицательных результатов в сравнении с общепринятыми серологическими методами - в частности с чувствительным двухстадийным папаиновым тестом. Более эффективное использование рабочего времени персоналом лабораторий благодаря сокращению времени на исследование и дополнительные процедуры позволяет быстро и качественно выполнять весь спектр трудоемких анализов.

Часто оспаривается клиническое значение антител, выявляемых только ферментным методом, даже тогда, когда известно, что эти антитела принадлежат к группе клинически значимых. Однако, только непрямого антиглобулинового теста бывает недостаточно для выявления пула клинически значимых антител и его необходимо сочетать с чувствительной двухстадийной ферментной методикой, поэтому выявление всех клинически значимых антител различными методиками, а также определение слабых антител, которые могут стать сильнее при вторичной стимуляции (например, в течение беременности) должны выполняться максимально полно.

Проба на совместимость

Гелевый тест может быть использован для проведения проб на совместимость по антигенам эритроцитов перед переливанием крови. Для этого используются непрямой антиглобулиновый тест и одностадийный ферментный метод. Гелевый тест выполняется и оценивается по выше приведенным правилам. Отсутствие этапов отмывания эритроцитов при выполнении непрямого антиглобулинового теста позволяет более эффективно использовать рабочее время и сводится к минимуму зависимость результатов реакции от "рук" исполнителя.

Прямой антиглобулиновый тест

Когда эритроциты покрыты in vivo иммуноглобулинами и/или комплементом можно выполнять прямой антиглобулиновый тест в гелевой технологии с панелью моноспецифических антиглобулиновых реагентов для идентификации класса фиксированных антител. Это исследование более чувствительно по сравнению с общепринятыми методами и незаменимо при обследовании пациентов с аутоиммунной гемолитической анемией.

Обсуждение результатов

Гелевый тест является простым, воспроизводимым, быстрым и очень чувствительным методом, который после краткого обучения персонала, необходимого для правильного выполнения теста, сводит к минимуму затраты рабочего времени и ошибки встречающиеся при использовании традиционных методик.

Гелевый тест позволяет стандартизировать лабораторные методики и автоматизировать оценку результатов реакции гемагглютинации. Стабильность результатов теста позволяет перепроверять полученные данные, что необходимо для контроля. Результаты теста могут быть фотокопированы для сохранения их в архиве или служить учебным пособием в сложнодиагносцируемых случаях.

Так как для теста используется небольшое количество сыворотки или эритроцитов, гелевая технология незаменима для педиатрических клиник, когда получение достаточного количества исследуемого материала затруднено.

Использование гелевой системы позволяет снизить риск заражения персонала даже при работе с потенциально инфицированными образцами.

Пластиковые ID-карты сделаны из биоразлагаемого материала, легко утилизируются и не загрязняют окружающую среду.

Тест-системы стабильны около года и сохраняются около года при комнатной температуре.

Стандартные эритроциты также имеют довольно долгий срок хранения (до 8-и недель), что удобно для лабораторий с небольшим объемом исследований в день.