Статьи, буклеты и литература по HLA-типированию

Сравнение процедур HLA-генотипирования на основе rSSO, SBT и Micro SSP

SBT (sequence-based typing) - метод, применимый для HLA-генотипирования преимущественно в условиях научно-исследовательских учреждений, причем только для определения последовательности ДНК-мишени de novo (то есть для секвенирования неизвестной последовательности ДНК). Компания OneLambda предлагает наборы реагентов ConsenSys для считывания последовательностей амплифицированной ДНК, полученных в результате генотипирования реагентами LABType SSO. В наборы ConsenSys SBT входят праймеры для секвенирования и два буфера для промывки.

rSSO (reverse sequence specific oligonucleotides) - метод HLA-генотипирования на основе ПЦР с последующей гибридизацией и анализом. Компания OneLambda предлагает наборы LABType SSO (средневысокого разрешения) и LABType HD (высокого разрешения) для типирования локусов HLA A, B, C, DRB1, DRB3,4,5, DQA1/DQB1 и DPA1/DPB1. Наборы One Lambda покрывают большее число аллельных вариантов, чем наборы других производителей.

Совместное использование наборов LABType HD и LABType SSO HLA Exon 4-7 Supplement позволяет избежать секвенирования образцов, поскольку даёт возможность получения результатов высокого типирования с аллельным разрешением в соответствии с требованиями EFI/ASHI, включая типирование всех требуемых экзонов (со 2 по 7).

Используя метод rSSO, один сотрудник может провести от 1 до 1000 полных (по ВСЕМ локусам) генотипирований в сутки. Поэтому она не имеет альтернатив при создании Регистров доноров костного мозга и для создания Банков пуповинной крови (Банков стволовых клеток).

SSP (sequence specific primers) - в основе метода лежит полимеразная цепная реакция с аллель-специфическими праймерами. Детекция результатов амплификации происходит методом электрофореза в геле. Интерпретация результатов HLA-типирования сводится к однозначному да/нет - присутствие или отсутствие продуктов ПЦР. При HLA-генотипировании методом SSP один сотрудник может оттипировать от 1 до 10 пациентов (в зависимости от числа типируемых локусов и количества определяемых аллелей).

Выбор метода HLA-генотипирования

Преимущества и недостатки методов HLA-генотипирования

В клинических условиях определение однонуклеотидных замен (SNP), представляющих собой точечные различия в последовательностях генов, для которых в различных популяциях имеются аллельные варианты, методом SBT нерационально. Поскольку главными недостатками технологии SBT по сравнению с методом rSSO являются:

• трудоемкость (сложная и длительная процедура подготовки ДНК для секвенирования);
• низкая производительность;
• высокая стоимость оборудования и реагентов и, как следствие, высокая себестоимость типирования одного образца;
• отсутствие у компаний-производителей секвенаторов специальных реагентов, оборудования и программного обеспечения для серологического типирования и для определения антител к антигенам HLA. При практической работе в области трансплантологии абсолютно необходимо выявление предсуществующих и посттрансплантационных антител к антигенам HLA, что позволяет определять реальный иммунный ответ организма на трансплантацию, на который, кроме HLA-генотипа реципиента и донора, влияют и результаты предыдущих трансплантаций и трансфузий, а самое главное – позволяет проводить мониторинг процесса приживления пересаженных органов, тканей и клеток и осуществлять пожизненное пост-трансплантационное ведение пациента.

Метод SSP требует большого количества времени, квалифицированного ручного труда, и не предназначен для HLA-типирования в условиях клиники, предполагающих большие потоки анализов. Метод идеален для дотипирования образцов, HLA-тип которых предварительно установлен при помощи наборов OneLambda LABType SSO.

В качестве примера последовательность этапов генотипирования с применением различных технологий при подборе донора для трансплантации костного мозга должна выглядеть следующим образом:

1. генотипирование большого количества образцов по технологии rSSO со средневысоким разрешением для сужения круга возможных доноров;
2. генотипирование по технологии SSP для разрешения неоднозачностей, полученных при генотипировании методом rSSO;
3. генотипирование с высоким разрешением реципиента и донора с применением наборов LABType SSO HD и LABType SSO HLA Exon 4-7 Supplement для получения аллельного разрешения (аналогичное разрешение достигается при секвенировании);
4. определение уровня серопозитивности доноров и реципиента;
5. Мониторинг уровня посттрансплантационных антител и профиля специфичности антител к антигенам HLA.

Необходимо применять все технологии HLA-типирования. Технологии rSSO и SSP не конкурируют, а дополняют друг друга.

Преимущества системы rSSO по сравнению с SSP

• мультиплексное типирование (свыше 200 аллелей в одном локусе);
• возможность выявления точечных мутаций - до 100 различных мутаций в одной пробе);
• одна процедура амплификации для всех типирований (в отличие от техники SSP (Protrans) не нужно подбирать условия для каждой пары праймеров);
• высокая производительность (анализ на проточном анализаторе LabScan 100 занимает 1 мин на пробу, т.е. на считывание 96-луночного планшета уходит 96 мин);
• минимум ручного труда - минимальное влияние субъективных факторов на результаты типирования;
• постгибридизационная стабильность амплифицированных проб с олигонуклеотидами на поверхности микросфер (амплифицированные пробы можно хранить на холоду несколько часов, а затем провести повторное считывание на проточном анализаторе);
• гибкость LABType SSO - система удобна для единичных исследований, но в случае необходимости позволяет увеличить количество проводимых в лаборатории типирований до 1000 в день.

Компания OneLambda производит оборудование, реагенты и программное обеспечение для HLA-типирования методами SSP, rSSO и серологического метода - идеальное решение в клинических условиях (в том числе, при создании регистров доноров).

Чувствительность системы LABType SSO позволяет выявлять точечные мутации генов HLA (проводить тонкое типирование), поэтому секвенирование локусов генов HLA не требуется.

OneLambda Inc. предлагает ряд инновационных продуктов для HLA-типирования. Наборы LABType SSO MICA, LABScreen MICA Single Antigen и KIR SSO Genotyping Test позволяют прогнозировать эффективность трансплантаций на основе типирования MIC белков А и В (MICA и MICB) и KIR-рецепторов, ответственных за контроль различных проявлений иммунной реактивности, в частности, реакции тканевой несовместимости.

Доказательством преимуществ оборудования и реагентов OneLambda может служить то, что в США – мировом лидере в области трансплантологии – до 90% типирований осуществляется с их применением, и большинство Международных и Национальных регистров доноров функционирует на основе технологии OneLambda.

Наименование	Объем	Производство	Метод	Кат.Номер
2009 Clinical Histocompatibility Workshop - Evian-les-Bains, France		One Lambda		VIS09E
2009 Clinical Histocompatibility Workshop -Rancho Mirage, CA		One Lambda		HLA-VIS09
2010 Clinical Histocompatibility Workshop - Malta		One Lambda		VIS10E
2010 Clinical Histocompatibility Workshop - Maui, HI		One Lambda		HLA-VIS10
Clinical Transplant 2006		One Lambda		CLTX-06
History of ΗLA		One Lambda		HLA-HIS