ПЦР в реальном времени

• Амплификаторы в режиме реального времени Agilent
• Амплификаторы в режиме реального времени Analytik Jena (Biometra)
• Амплификаторы в режиме реального времени Bioer
• Амплификаторы в режиме реального времени EASTWIN
• Амплификаторы в режиме реального времени Thermo Fisher Scientific
• Амплификаторы в режиме реального времени АНК
• Амплификаторы в режиме реального времени ДТпрайм

В настоящее время в практическое здравоохранение внедряется новая технология ПЦР — ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ, Real-Time PCR). Ее принципиальной особенностью является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции, а также автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории. Благодаря экономии производственных площадей, уменьшению количества персонала и востребованности количественного определения ДНК/РНК этот метод в последние годы успешно применяется в крупнейших санитарно-эпидемических, диагностических и научно-исследовательских центрах развитых стран мира, замещая ПЦР в ее сегодняшнем («классическом») формате.

Оборудование и расходные материалы для ПЦР анализа в реальном времени

Амплификатор для ПЦР в реальном времени Gentier Mini	Термоциклер для ПЦР в реальном времени Gentier 48E	Система ПЦР в реальном времени Gentier 96E
Амплификатор в режиме реального времени Mx3005P	Амплификатор в режиме реального времени Mx3000P	Амплификатор в режиме реального времени TOptical
Термоциклер для ПЦР в реальном времени PikoReal	Система ПЦР в реальном времени Applied Biosystems 7500	Амплификатор в режиме реального времени АНК-32-М
Экспресс-амплификатор в режиме реального времени АНК-4	Реагенты для ПЦР	Системы для выделения и очистки нуклеиновых кислот
Лабораторный пластик и посуда	Автоматические пипетки	Центрифуги и вортексы
Амплификатор для ПЦР в реальном времени Smart Cycler II	ПЦР боксы для стерильных работ	Термоблоки

Существует два основных подхода к детекции результатов ПЦР в реальном времени: с помощью интеркалирующих красителей и на основе флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов.

Низкоспецифичная детекция результатов ПЦР-РВ с помощью интеркалирующих красителей

Детекция продуктов амплификации возможна за счет увеличения флуоресценции интеркалирующего красителя при образовании комплекса с двуцепочечной ДНК. Самый популярный краситель на сегодняшний день - SYBR Green I. Это чувствительный флуоресцентный индикатор двухцепочечной ДНК. Максимум флуоресценции в комплексе с ДНК составляет 521 нм, максимум возбуждения - 497 нм (второй максимум около 254 нм). Хорошо возбуждается стандартным 488-нм лазером. Квантовый выход флуоресценции - около 0.8 (что в 5 раз превышает квантовый выход комплекса этидий-ДНК).

Реже применяются красители EVA Green, LCGreen, Cyto9. Низкая специфичность детекции результатов ПЦР-РВ при использовании интеркалирующих красителей обусловлена тем, что флуореценция раствора вызывается накоплением любой двуцепочечной ДНК в реакционной смеси, в том числе и неспецифической! Следовательно, остается вероятность регистрации ложноположительного результата.

Как работает ПЦР в реальном времени c использованием специфичных зондов?

Более высокой специфичности детекции результатов ПЦР в режиме реального времени можно достигнуть за счет наличия в реакционной смеси дополнительного олигонуклеотида - гибридизационного зонда. Такой зонд "отжигается" (комплементарно соединяется с ДНК) на участке ампликона меджу прямым и обратным праймером. На разных концах зонда расположены флуорофор и тушитель флуоресценции этого красителя. Когда флуорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. Во время процесса амплификации за счет 5`-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем и генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата.

Таким образом, в случае если используемые праймеры "отожгутся" на неспецифических участках с образованием в ходе ПЦР-РВ "нецелевого" продукта, то его последовательность не будет иметь участок, комплементарный гибридизационному зонду и, соответственно, "нецелевые" ампликоны не будут регистрироваться как целевые. При этом для такого варианта ПЦР-РВ можно одновременно использовать несколько видов красителей и гасителей их флуоресценции (с неперекрывающими спектрами излучения). Это позволяет осуществлять мультиплексную ПЦР.