 |
| ||||||
| |||||||
| / Каталог / Протеомика / Белки | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Рекомбинантные белки
Рекомбинантные белки получены с помощью генной инженерии, так же называемой сплайсингом генов или методом рекомбинантных ДНК. Путем помещения генов человека, животных или растений в генетический материал клеток бактерий, млекопитающих или дрожжей, эти микроорганизмы могут использоваться как продуценты белков для медицинских, научных и исследовательских целей. Вектор - фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый организм или другой, удобный для выращивания. Очистка и экспрессия белков часто может быть сложной и занимать много времени, поэтому используют дополнительный конец к специфической последовательности ДНК, который облегчит очистку и экспрессию рекомбинантных белков. Рекомбинантные белки - это белки, ДНК которых была создана искусственно. ДНК из двух или более источников включают в одну рекомбинантную молекулу. ДНК сначала обрабатывается эндонуклеазой рестрикции. В результате образуется ДНК с "липкими концами", которая может соединяться с любой молекулой ДНК, имеющей комплементарные липкие концы. ДНК лигаза ковалентно связывает 2 нити в одну рекомбинантную молекулу ДНК. Рекомбинантная молекула ДНК должна быть реплицирована много раз для получения материала для анализа и секвенирования. Производство множества идентичных копий молекулы ДНК называют клонированием. Клонирование проводится in vitro с помощью полимеразно-цепной реакции (ПЦР). Клонирование in vivo может проводиться у одноклеточных микробов (например, E. coli), одноклеточных эукариот (дрожжи) и в клетках культур тканей млекопитающих. Рекомбинантные ДНК должны быть получены клеткой в форме, в которой она может быть реплицирована и экспрессирована. Это достигается путем помещения ДНК в вектор. Ряд вирусов (как в клетках бкатерий, так и в клетках млекопитающих) могут служить в качестве векторов. Рекомбинантная ДНК также иногда называется "химерой" при соединении двух или более типов ДНК. Существует три различных метода получения рекомбинантной ДНК: 1. Трансформация. 2. Трансфекция фагов. 3. Трансформация в клетках дрожжей, растений и млекопитающих. В первом случае необходимо выбрать участок ДНК, который должен быть инсерцирован в вектор с помощью ДНК лигазы. Инсерт содержит селектируемый маркер, который обеспечивает идентификацию рекомбинантных молекул. Трансформация - это инсерция вектора в клетку хозяина. Клетки-хозяева приготовлены для получения инородной ДНК. Селектируемые маркеры используются для устойчивости к антибиотикам, изменения цвета или других характеристик, которые могут отличать трансформируемые клетки-хозяева от нетрансформируемых. Трансформацию клеток дрожжей, растений или млекопитающих производят путем микро-инъекций ДНК в ядра трансформируемых клеток. Процесс трансфекции с помощью фагов эквивалентна трансформации за исключением того, что вместо бактерий используется фаг лямбда или MI3. Значительные количества рекомбинантных белков производятся в клетках-хозяевах только при добавлении генов экспрессии. Экспрессия белков зависит от генов, окружающих интересующую ДНК, этот набор генов действует как сигнал, который запускает транскрипцию и трансляцию нужной ДНК в клетке. Эти сигналы включают промотор, сайт связывания рибосом и терминатор. Рекомбинантная ДНК инсерцируется в экспрессионный вектор, который содержит промотор, сайт связывания рибосом и терминатор. Ген не должен содержать интронов человека, поскольку бактерии не распознают их и это может стать причиной преждевременной терминации, и синтез или сборка белка могут быть нарушены. Белки содержат сайты связывания металлов, которые могут быть использованы для очистки рекомбинантных или природных белков. Шесть или более идентичных гистидиновых остатков действуют как сайт связывания металлов для очистки и экспрессии белков. Последовательность hexa-His называют His-концом, который может быть помещен на N-конец белка-мишени. His-конец содержит сайт расщепления для специфических протеаз. Рекомбинантные белки с His-концом очищены методом метало-хелат аффинной хроматографии на никелевых ионных колонках, рекомбинантные белки после элюированы из метал-хелатной колонки с помощью гистидина или имидазола. Затем очищенный белок с His-концом обрабатывают с помощью специфической протеазы для отщепления His-конца, или не обрабатывают, если His-конец не влияет на активный сайт белка. Информация для заказа
|
Рекомбинантные белки - результат новых комбинаций генов, которые формируют ДНК. Рекомбинантные технологии ДНК позволяют получать белки дикого типа и модифицированные белки человека и млекопитающих в больших количествах. Рекомбинантные белки получены на основе клонированных последовательностей ДНК, которые обычно кодируют ферменты и белки с известными функциями.
|
|
© ООО «Лабораторная Диагностика» info@LD.ru тел.: +7 495 369-20-43 |