Дуплекс-специфичная нуклеаза

- Специфически гидролизует двухцепочечную ДНК
- Термостабильна
- Устойчива к протеиназе К

Дуплекс-специфическая нуклеаза (ДСН) очищена из гепатопанкреаса камчатского краба с помощью модифицированного протокола, описанного Шагиным и соавт. (Shagin et al., 2002). ДСН – термостабильная нуклеаза, обладающая специфичностью к двухцепочечной (дц) ДНК. ДСН проявляет гидролитическую активность в присутствии ионов двухвалентных металлов (например, Mg²⁺).

ДСН может быть использована для удаления двухцепочечной ДНК из сложных смесей нуклеиновых кислот, например при нормализации образцов кДНК (Zjulidov et al., 2004; 2005) или при определении длины выступающих теломерных концов (Zhao et al., 2008).

КАТ.#

КОЛ-ВО

КОМПОНЕНТЫ НАБОРА

ИНСТРУКЦИЯ (pdf, англ.)

Продукты предназначены только для научно-исследовательских работ, осуществляемых квалифицированным персоналом. Продукты не предназначены для лечения и диагностики заболеваний.

EA001

50 ед. Куница

Лиофилизированная дуплекс-специфическая нуклеаза (ДСН)
Буфер для хранения ДСН, 100 мкл
10Х ДСН буфер, 100 мкл
ДСН стоп-раствор, 500 мкл
Контрольная плазмидная ДНК (0,1 мкг/мл), 20 мкл

EA002

100 ед. Куница

EA003

10 ед. Куница

Хранение: +4°С для лиофилизированного фермента, -20°С для остальных компонентов. После растворения фермента он должен храниться при -20°С.
Транспортировка: комнатная температура
Срок хранения: при соблюдении условий хранения и транспортировки - 1 год.

Измерение активности: Активность ДСН измеряют с помощью модифицированного метода Куница (Kunitz, 1950), где за единицу активности принимают кол-во фермента, которое при добавлении к 50 мкг/мл ДНК из тимуса теленка приводит к увеличению абсорбции раствора на 0,001 единицу за минуту. Измерение активности проводят при 25°C в 50мМ Tris-HCl буфере (pH 7,15), содержащем 5мМ MgCl₂.

Основные свойства ДСН

1. Mg²⁺-зависимая нуклеаза, необходимая концентрация ионов магния для большинства приложений - 5 мМ. Ингибируется в присутствии ЭДТА.
2. Субстратная специфичность: ДНК в ДНК-ДНК (минимальная длина спаренной последовательности субстрата - 9-10 п.о.) и ДНК-РНК гибридах (минимальная длина спаренной последовательности субстрата - 15-20 п.о.)
3. Температурный оптимум: 55-65°С
4. рН оптимум: 7-8
5. рН стабильность: от 4 до 12
6. Устойчива к обработке протеиназой К при обработке при 37°С
7. Температурная стабильность:

ТЕМПЕРАТУРА	ОСТАТОЧНАЯ АКТИВНОСТЬ*, %
* Остаточная активность после 30-мин прогревания
60°С	100
70°С	60
80°С	40
90°С	меньше 10

Действие ДСН на оц- (ДНК фага M13) и дц- (ДНК фага λ) ДНК-субстраты.

1, 2 - отрицательный контроль, инкубация ДНК в отсутствие ДСН: (1) ДНК фага M13; (2) смесь ДНК фага M13 и ДНК фага λ. 3; 4 - инкубация смеси ДНК фага M13 и ДНК фага λ в присутствии ДСН при 70°C в течение 1,5 мин (3) и 5 мин (4).

Список литературы:

Kunitz M. Crystalline desoxyribonuclease; digestion of thymus nucleic acid; the kinetics of the reaction. J Gen Physiol. 1950; 33 :363-377.
Shagin DA, Rebrikov DV, Kozhemyako VB, Altshuler IM, Shcheglov AS, Zhulidov PA, Bogdanova EA, Staroverov DB, Rasskazov VA, Lukyanov S. A novel method for SNP detection using a new duplex-specific nuclease from crab hepatopancreas. Genome Res. 2002; 12 (12):1935-42. / pmid: 12466298
Zhao Y, Hoshiyama H, Shay JW, Wright WE. Quantitative telomeric overhang determination using a double-strand specific nuclease. Nucleic Acids Res. 2008; 36 (3):e14. / pmid: 18073199
Zhulidov PA, Bogdanova EA, Shcheglov AS, Shagina IA, Wagner LL, Khazpekov GL, Kozhemyako VV, Lukyanov SA, Shagin DA. A method for the preparation of normalized cDNA libraries enriched with full-length sequences. Bioorg Khim. 2005; 31 (2):186-94. (in Russian)/ pmid: 15889793
Zhulidov PA, Bogdanova EA, Shcheglov AS, Vagner LL, Khaspekov GL, Kozhemyako VB, Matz MV, Meleshkevitch E, Moroz LL, Lukyanov SA, Shagin DA. Simple cDNA normalization using kamchatka crab duplex-specific nuclease. Nucleic Acids Res. 2004; 32 (3):e37. / pmid: 14973331