Флюоресцентная гибридизация in situ

Метод FISH и его вариации

Перейти в раздел Приборы и реагенты для FISH - анализа 

Метод гибридизации in situ* (на месте, лат.) основан на способности ДНК или РНК образовывать устойчивые гибридные молекулы с ДНК / РНК - зондами непосредственно на препаратах фиксированных хромосом и интерфазных ядер. С помощью этого метода можно определить точное местоположение практически любой последовательности ДНК или РНК непосредственно в клетке, клеточном ядре или на хромосомах.

Для проведения гибридизации in situ пригодны цитологические или гистологические препараты клеток любых тканей или органов, приготовленные по стандартным методикам. В условиях клинической цитогенетической лаборатории используют препараты культивированных лимфоцитов периферической крови, клеток цитотрофобласта хорионального эпителия, культивированных и некультивированных клеток амниотической жидкости, различных тканей из абортного материала, а также мазков клеток буккального эпителия и крови.

Метод гибридизации in situ имеет особое значение для практической цитогенетики, благодаря разработке неизотопного варианта, основанного на использовании зондов, меченных нерадиоактивными модифицированными нуклеотидами. Неизотопные варианты гибридизации на препаратах (в особенности флюоресцентные) имеют ряд преимуществ по сравнению с изотопными: большую разрешающую способность, которая равна разрешающей способности микроскопа (0,1 - 0,2 мкм), отсутствие необходимости в статистической обработке результатов, быстроту и безопасность для здоровья исследователей

Кроме того, комбинация различно модифицированных проб, выявляемых с помощью разных систем детекции, позволяет одновременно определять местоположение двух и более последовательностей ДНК в одной клетке или на одной метафазной пластинке. А использование в качестве ДНК-зондов повторяющихся последовательностей, меченых флюорохромами, сокращает время проведения процедуры до 7 - 9 часов (классический неизотопный вариант гибридизации занимает два дня, изотопные варианты от недели до месяца), что особенно важно для пренатальной диагностики. Использование метода FISH в цитогенетической диагностике позволяет идентифицировать структурные хромосомные перестройки, устанавливать природу маркерных хромосом, проводить анализ численных нарушений хромосомного набора, как на метафазных хромосомах, так и в интерфазных ядрах.

Принцип FISH-метода

В основе FISH-метода лежит реакция гибридизации между искусственно созданным ДНК-зондом и комплементраной ему нуклеотидной последовательностью ядерной ДНК. Молекула ДНК представляет собой две спирально соединенные нуклеотидные цепи, а гибридизация возможна только в том случае, если цепи разойдутся. Чтобы разъединить нуклеотидные цепи ДНК прибегают к денатурации (для последующей гибридизации денатурированной должна быть как ДНК в ядрах исследуемого образца, так и сам ДНК-зонд). После денатурации ДНК-зонд гибридизуется с комплементарной ему нуклеотидной последовательностью и может быть обнаружен при помощи флуоресцентного микроскопа.

Таким образом, общий вид протокола для постановки FISH можно представить в следующем виде:

1. Подготовка гистологического или цитологического препарата.
Подготовка гистологического препарата осуществляется по стандартной схеме: вырезка, маркировка, проводка, заливка, микротомия, помещение среза на предметное стекло и депарафинизация. При подготовке цитологического препарата используются специальные осаждающие растворы и центрифугирование, что позволяет получить концентрированную суспензию клеток.

2. Предварительная обработка (если необходимо).
Препарат обрабатывается протеазами, чтобы исключить присутствие белков, которые затрудняют гибридизацию.

3. Нанесение ДНК-зонда на препарат и последующая денатурация.
Для того, чтобы денатурировать зонд и ДНК образца, их обрабатывают формамидом и нагревают до температуры около 85-90°С.

4. Гибридизация.
После денатурации препарат охлаждают до определенной температуры (37°С в случае клинических исследований) и инкубируют во влажной камере в течение нескольких часов (продолжительность инкубации указана в каждом конкретном протоколе). В настоящее время для денатурации и гибридизации используют автоматические гибридайзеры.

5. Промывка.
После того, как гибридизация завершена, необходимо отмыть несвязавшиеся зонды, которые, в противном случае, создадут фон, затрудняющий оценку результатов FISH-анализа. Для промывки обычно используют раствор, содержащий цитрат и хлорид натрия (SSC).

6. Контр-окрашивание.
При помощи флуоресцентных красителей (DAPI - 4,6-диамидин-2-фенилиндол; йодид пропидия) проводится окраска всей ядерной ДНК.

7. Анализ результатов при помощи флуоресцентного микроскопа. Выполнение рутинных операций (депарафинизация, предварительная обработка, промывка) может быть автоматизировано.

Перейти в раздел Приборы и реагенты для FISH - анализа 

* - Материал подготовлен на основе информации открытых источников.