Иммунофлюоресцентный анализ

Известны прямой и непрямой методы иммунофлюоресцентного анализа. В прямом методе искомый антигенный субстрат отыскивают в ткани посредством соответствующей АС. Сам антиген может быть антителом; в таком случае конъюгат будет представлять собой меченое анти-антитело. Непрямой метод применяется при определении антител (антигенов) в жидкостях или в том случае, когда, как упоминалось выше, нет подходящей меченой антисыворотки. Специальной формой непрямого метода является фиксация комплемента антителами. Чувствительность метода, возможность ошибок и количество необходимых контрольных операций возрастают параллельно усложнению процедуры иммунофлюоресцентного анализа. В ходе анализа реакция антиген-антитело протекает непосредственно на субстрате, все непрореагировавшие компоненты удаляют смыванием.

Материалы и оборудование

Для работы необходимы ФСБ с рН 7,2; лепиналовый буфер с рН 7,2; 0,575 г лепинала, 0,185 г лепинал-натрия, 0,028 г СаС1, 0,168 г MgCl₂-6H₂0, 8,5 г NaCl, дистиллированная вода до 1000 мл. Среда для заключения ткани: глицерин на лепиналовом буфере с рН 8,6 (10,3 г лепинал-натрия, 6,2 г NaCl, дистиллированная вода до 1000 мл). Подводят рН до 8,6 HCI и смешивают с глицерином в соотношении 1 + 3. Также нужны пипетки с поршнем, инкубационная камера, кюветы для окрашивания, устройство для встряхивания.

Методика

Растворы при помощи поршневых пипеток осторожно наносят на препараты, следя за тем, чтобы они были полностью покрыты жидкостью. Инкубацию проводят при комнатной температуре во влажной камере в течение 30 минут. После инкубации растворы отсасывают очень осторожно, чтобы не сдвинуть с места соседние препараты. Отмывают препараты фосфатно-солевым буфером в кюветах, на аппарате для встряхивания. Буфер меняют с различной частотой в зависимости от цели исследования (см. ниже).

Прямой метод иммунофлюоресцентного анализа

— Препарат отмывают ФСБ в течение 10 минут (однократная смена буфера), высушивают.
— Инкубируют препарат с различными разведениями коньюгата.
— Препарат промывают ФСБ в течение 30 минут (троекратная смена буфера).
— Препарат высушивают и заключают в подходящий материал.

Непрямой метод иммунофлюоресцентного анализа

— Препарат инкубируют с исследуемым раствором.
— Отмывают ФСБ в течение 20 минут (двукратная смена буфера).
— Инкубируют с различными разведениями конъюгата.
— Отмывают в ФСБ в течение 30 минут (троекратная смена буфера).
— Препарат высушивают, заключают в подходящий материал.

Определение комплементсвязывающих антител

После первой инкубации с инактивированной сывороткой (30 мин, 56°С), последующей отмывки, как при прямом иммунофлюоресцентном анализе, и высушивания проводят следующие манипуляции:

— Инкубация со свежей человеческой сывороткой (разведение 1+9) в качестве источника комплемента.
— Отмывка в ФСБ в течение 20 минут (двухкратная смена буфера) .
— Инкубация с антителами к комплементу человека (СЗ), мечененными ФИТЦ.
— Отмывка в ФСБ в течение 30 минут (троекратная смена буфера).
— Высушивание и заключение в подходящую ткань.

Комплемент рекомендуется разливать на небольшие порции и хранить в жидком азоте. Нужную порцию комплемента размораживают перед употреблением и разводят лепиналовым буфером с рН 7,2.

Применение двойной флюоресцентной метки

Для одновременного анализа различных антигенов в одной и той же ткани, например в клетках одного типа, применяют антисыворотки, меченные различными флюорохромами (ФИТЦ,ТРИТЦ). Такая маркировка применяется при диагностике лимфом и точного анализа антигенов, вызывающих образование аутоантител.

Окрашивание дополнительным цветом

Окрашивание дополнительным цветом применяется для облегчения ориентации в полях зрения, облегчения установки нужных деталей, повышения контрастности. Усиления контрастности можно достичь за счет подавления фоновой флюоресценции синим Эванса (0,1 г/л, 30—60 с, последующая отмывка ФСБ дважды по 5 минут). Для облегчения установки нужных деталей, особенно в случае объектов с незначительной нежелательной флюоресценцией, можно воспользоваться дополнительным окрашиванием альбумином, меченным родамином или бромистым этидием (10 мг/л, 2 мин). Ядра нежизнеспособных клеток приобретают оранжево-красную окраску.

Контроль качества анализа

В иммунофлюоресцентном анализе используют различные виды контроля для предотвращения ошибок и правильной оценки данных.

Контроль собственной флюоресценции объекта: проверяют объект без специальной обработки, например только после промывания.

Контроль конъюгата: объект инкубируют только с конъюгатом. Этот вид контроля применяется в непрямом методе анализа. Контроль позволяет установить наличие собственной флюоресценции препарата, а также наличие нежелательных реакций конъюгата с объектом.

Отрицательный контроль: в прямом методе анализа применяется для гарантии отсутствия соответствующего антигена (ткань, заведомо не содержащая соответствующего антигена). В непрямом методе анализа используют сыворотку, которая не содержит антител к исследуемому объекту, например донорские сыворотки. Обработку материала проводят, как для положительного контроля. Отрицательный контроль устанавливает неспецифическую флюоресценцию объекта вследствие неспецифического связывания иммуноглобулин. По отношению к этому контролю оценивают разведения исследуемых сывороток. При высоких разведениях наблюдается такая же картина, как при контроле конъюгата.

Положительный контроль: в прямом методе используют препарат, оказавшийся положительным в ранее проведенных исследованиях. В непрямом методе в качестве положительного контроля используют заведомо положительную сыворотку. Контроль устанавливает реакционную способность ткани или конъюгата. В случае многоступенчатых реакций контролю должен подвергаться каждый этап.

Определение комплементсвязывающих антител:
Контроль комплемента: ткани или клетки, заведомо не содержащие комплементсвязывающие антитела, инкубируют с комплементом или конъюгатом. Контроль показывает, содержит лн сыворотка с комплементом антитела к антигенам исследуемого препарата. Для оценки специфичности антигена или антител можно воспользоваться адсорбцией сывороток определенным антигенами с последующим отделением иммунных комплексов. Можно применять предварительную инкубацию препарата с антителами соответствующей специфичности, но принадлежащими другому биологическому виду (лучше всего к тому, от которого получена сыворотка для конъюгата); положительная реакция в этих случаях выражена слабее или вообще не наблюдается.

Титрование в шахматном порядке

Каждую новую серию конъюгата с целью определения оптимального разведения для непрямого метода проверяют титрованием в шахматном порядке с позитивными и негативными контрольными сыворотками. Схема перекрестной проверки представлена в таблице.

Пример титрования в шахматном порядке для определения оптимального рабочего разведения конъюгата

Обозначения:

Ø — отрицательная реакция, т. е. отсутствие субъективного восприятия специфической флюоресценции;
X — интенсивная неспецифическая или нежелательная специфическая флюоресценция;
± — слабая специфическая флюоресценция; субъективно ее можно спутать с отрицательным контролем;
+ , + +, + + +  — специфическая флюоресценция от отчетливой до очень сильной.
КП — конец плато, здесь при разведении конъюгата 1 : 80;
ВСП — выход титра сыворотки на плато, здесь 1 : 320;
Рекомендуемое рабочее разведение конъюгата: 2—4-кратная концентрация конъюгата в КП; рекомендуется разведение 1:30.

Среды для заключения и хранения препаратов

Заключение препаратов в водосодержащие среды при рН 8,6 обеспечивает самую высокую степень флюоресценции и наименьшее «выцветание». Препараты, высушенные и заключенные в неполярные среды, например иммерсионное масло (Piaflex химический комбинат Пистериц), энтеллан (Merck, Дармштадт), UV инертную (Serva, Гейдельберг), обладают только 50% интенсивностью флюоресценции и вдвое более сильным «выцветанием» по сравнению с препаратами, заключенными в водные среды. Среда для заключения расходуется экономно и по возможности без образования пузырей воздуха. Референс-препараты в высушенном виде хранятся при 4°С, в среде для заключения — при —20°С.