Лейкоцитарные тесты

Лейкоцитарные тесты  группа диагностических тестов, в которых показателем для оценки специфической реактивности организма и функции иммунной системы служат изменения различных свойств лейкоцитов. К лейкоцитарным относятся тест розеткообразования, бластотрансформация лимфоцитов, торможение миграции макрофагов, аллергическая альтерация лейкоцитов и тест с глюкокортикоидрезистентной фракцией лимфоцитов.

Тест розеткообразования основан на различиях рецепторной структуры лейкоцитов (лимфоцитов, гранулоцитов, моноцитов), которые при взаимодействии с эритроцитами могут спонтанно присоединять последние к своей поверхности. При этом образуются фигуры, напоминающие розетки, в центре которых находится лейкоцит, а вокруг него располагаются не менее 35 эритроцитов. Существует несколько вариантов этого теста. При прямом тесте в формировании розеток участвуют антигены самих эритроцитов, а при непрямом  антигены, искусственно фиксированные на поверхности эритроцитов. При прямом тесте образуются спонтанные и иммунные розетки: спонтанные розетки  между лимфоцитами человека или животных и эритроцитами барана; иммунные  с эритроцитами, использованными для иммунизации донора лейкоцитов. Прямой тест используют для определения количества Т-лимфоцитов (т.к. эти клетки несут рецепторы к эритроцитам барана), широко применяют для оценки иммунного статуса, а в некоторых случаях  для выделения В-клеток. Розетки могут формироваться за счет иммуноглобулинов, которые образуются в В-клетках или фиксируются на клетках (гранулоцитах, моноцитах). Феномен розеткообразования может возникать не только с эритроцитами, но и с другими клетками и искусственными гранулами.

Сущность метода заключается в выделении взвеси лейкоцитов (лимфоцитов) обследуемого, инкубации их со взвесью эритроцитов барана (обработанных или не обработанных антигеном) и подсчета числа розеткообразующих клеток.

Бластотрансформация лимфоцитов  превращение малых зрелых лимфоцитов в малодифференцированные клетки типа бластов. Различают спонтанную и индуцированную бластотрансформацию лимфоцитов. Последняя возникает под влиянием неспецифических митогенов или специфических аллергенов (антигенов). К взвеси лейкоцитов крови добавляют раствор аллергена, смесь культивируют в течение 57 дней, а затем под микроскопом определяют процентное содержание лимфобластов в окрашенных мазках. Для более точной оценки бластотрансформации лимфоцитов к взвеси клеток добавляют 3Н-тимидин, который включается в ДНК клеток. По разнице радиоактивности образцов клеток, культивированных с антигеном и без него, судят о степени специфической бластотрансформации лимфоцитов под влиянием аллергена (антигена).

Торможение миграции макрофагов происходит под влиянием специфического антигена. Существует несколько модификаций теста, наиболее распространенный  капиллярный. В лунку с питательной средой помещают отрезок капилляра, заполненный клетками, и добавляют в нее испытуемый антиген. После культивирования клеток в течение 24 ч при 37 измеряют один из параметров мигрировавших из капилляра клеток (диаметр, площадь миграции и др.). Отношение опытного параметра к контрольному (без антигена) составляет индекс миграции. Реакция считается положительной, если опытные и контрольные показатели различаются более чем на 20%. Описаны методы оценки миграции клеток из капли агарозы, содержащей клетки, и миграции клеток из лунки под агарозу. В качестве тестируемых клеток в клинике наиболее часто используют лейкоциты крови, а в эксперименте  макрофаги и иногда лимфоциты. Тормозят миграцию клеток медиаторы, выделяющиеся из сенсибилизированных к данному антигену лимфоцитов, которые всегда присутствуют во взвеси испытуемых клеток: фактор торможения миграции макрофагов (MIF), фактор торможения миграции лейкоцитов (LIF) и др. Реакции торможения миграции макрофагов и лейкоцитов отражают состояние гиперчувствительности замедленного типа.

Аллергическая альтерация лейкоцитов повреждение лейкоцитов под влиянием специфического аллергена. Для выявления повреждения нейтрофильиых лейкоцитов используют тест ППН (показатель повреждения нейтрофилов) по Фрадкину. Кровь больных, страдающих аллергией, культивируют с аллергеном в течение 2 ч. Затем готовят мазки, которые окрашивают на гликоген с докраской ядер клеток гематоксилином. При положительном тесте наблюдается усиление амебоидной реакции нейтрофилов на аллерген, специфичный по отношению к циркулирующим в крови антителам. Амебоидная реакция сопровождается насыщением гликогеном псевдоподий клеток. Для оценки специфического повреждения лейкоцитов крови широко используется люминесцентная микроскопия. Пусковым механизмом аллергической альтерации клеток является образование комплекса, состоящего из аллергена и антител, связанных с поверхностью клеток. Альтерация лейкоцитов под влиянием специфического аллергена  показатель аллергии немедленного типа. Альтерация сопровождается не только морфологическими изменениями клеток, но и выделением из них биологически активных веществ, например освобождением гистамина.

Лейкоцитарный тест с глюкокортикоидрезистентной фракцией лимфоцитов относительная и абсолютная величина лимфоцитов в единице объема крови, устойчивая к литическому действию глюкокортикоидов. Все лимфоциты, толерантные в условиях культивации in vitro к литическому действию глюкокортикоидов, называются глюкокортикоидрезистентными. В зависимости от используемого глюкокортикоида их называют кортизолрезистентными, кортикостеронрезистентными и т.д. Тест отражает степень активации иммунной системы под влиянием антигенной стимуляции, позволяет оценивать изменения этой активации в процессе развития заболевания и, следовательно, имеет прогностическое значение. При инфекционных, инфекционно-аллергических и аллергических заболеваниях отмечается увеличение кортизолрезистентной фракции лимфоцитов. У взрослых в норме она составляет 6064% или 11001250 лимфоцитов в 1 млк крови.

Классификация т-клеток на основании теста розеткообразования

Результаты также позволяют предположить, что большинство В-клеток (SIg+-Е~) имеют Fc-рецепторы низкой авидности, так как они не задерживаются на колонках с иммунными комплексами, не обладающих антииммуноглобулиновой активностью. Более того, рецепторы к комплементу, по всей видимости, имеются и на SIg+- и на SIg~-клетках. Некоторые Рс+-клетки, видимо, имеют рецепторы к ЭБ и эти клетки скорее всего являются активными в К-клеточном тесте.

Остается выяснить вопрос, являются ли они Т-клетками.

Розетки, образующиеся между Т-клетками и ЭБ, нестойкие. При слабом встряхивании они распадаются. Только живые клетки способны образовывать розетки и только при оптимальных температурных условиях. Причина, лежащая в основе зависимости теста розеткообразования от температуры, не выяснена. Некоторые ферменты разрушают рецепторы к ЭБ, которые локализованы на лимфоцитах (трипсин, фосфолипаза А), в то время как другие ферменты (нейраминидаза, папаин) способствуют увеличению количества образующихся розеток.

Тимозин может ускорять взаимодействие Т-клеток с ЭБ; такое же действие оказывает фактор переноса.

Ранее были опубликованы некоторые данные об очистке и характеристике рецепторов к ЭБ. Руке и соавт. показали, что препарат активных рецепторов можно получить при экстракции ЗМ KG и путем частичной очистки, которая достигается при использовании в качестве специфических иммуносорбентов эритроцитов барана (ЭБ). Owen и Fanger использовали нейтрализацию ингибиции розеткообразования специфической аити-Т-сывороткой для выявления гликопротеиновой природы рецепторов к ЭБ.

В литературе была также отмечена возможность получения рецепторной активности из человеческой сыворотки крови и из супернатанта нагретых (45 °С) лимфоцитов.

Библиогр.: 

Иммунологические методы, под ред. X. Фримеля, пер. с нем., М., 1979;

Медуницын Н.В. Повышенная чувствительность замедленного типа, М., 1983;

Патогенез аллергических процессов в эксперименте в клинике, под ред. А.М. Чернуха и В.И. Пыцкого, с. 206, М., 1979;

Пыцкий В.И. и др. Методика определения глюкокортикоидрезистентной фракции лимфоцитов в периферической крови и лимфоидных органах, Пат. физиол. и эксперим. тер., 5, с. 82, 1986, библиогр.;

Фрадкин В.А. Диагностика аллергии реакциями нейтрофилов крови, М., 1985.

PS Подготовлено по материалам Интернета.