Метод флуоресцентной гибридизации (FISH)

Метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) был создан для определения конкретных последовательностей ДНК непосредственно на цитологических и гистологических препаратах. Данный метод позволил перейти от изучения морфологии хромосом к анализу последовательностей ДНК, входящих в их состав.

ДНК-зонд - это главный элемент при постановке FISH, так как определение хромосомной аномалии возможно только при наличии соответствующего зонда. Впервые in situ гибридизация с радиоактивным зондом, меченым изотопом 32Р, была описана в 1969 году. В последствии были разработаны нерадиоактивные флуоресцентные метки, что сделало метод in situ гибридизации безопасным, простым в исполнении и менее трудоемким при обработке результатов. Развитие технологий цифровой записи и архивирования микроскопических изображений, а также компьютерных систем для их анализа позволили создать принципиально новые подходы к решению задач по визуализации и идентификации хромосомного материала. В настоящее время можно выделить следующие основные подходы, которые широко используются в современной молекулярной цитогенетике:

1. идентификация материала протяженных хромосомных районов и целых хромосом;

2. детекция конкретной последовательности ДНК в определенном районе хромосомы;

3. анализ нарушения баланса отдельных хромосомных районов.

Современный ДНК-зонд, представляет собой нуклеотидную последовательность ограниченного размера, которая комплементарна определенному участку ядерной ДНК исследуемого цитогенетического препарата. Зонд несет "метку", то есть содержит нуклеотиды, связанные с флуорофором (молекула, способная к флуоресценции). В последнее время большое распространение получили зонды, меченные напрямую, в которых молекула флуорофора присоединяется при помощи ковалентной связи непосредственно к нуклеотидам зонда. Как правило, к каждому зонду присоединяют сразу несколько молекул флуорофора, чтобы, в конечном счете, получить качественную флуоресценцию. Существует три типа ДНК-зондов, принципиально отличающихся друг от друга.

Хромосом-специфичные (центромерные) зонды - СЕР (Chromosome Enumeration Probe) - предназначены для идентификации центромерных регионов хромосом и выявления количественных нарушений кариотипа (анеуплоидии) как в интерфазе, так и в метафазе. Они содержат относительно короткие нуклеотидные последовательности, комплементарные многочисленным хромосом-специфическим ?-сателлитным ДНК-повторам, локализованным в центромерном участке хромосом. Существуют пан-центромерные зонды, которые позволяют выявить одновременно центромерные регионы всех хромосом. Такие зонды используются для детекции анеуплоидии, полиплоидии, дицентрических хромосом и других комплексных аберраций. Можно также использовать и индивидуальные центромерные зонды к определенным хромосомам, если исследуемая патология связана с количественными нарушениями этих хромосом (моносомии, трисомии, нулисомии).

Ген-специфические зонды - LSI (Locus Specific Identifiers) - гибридизуются с уникальными (неповторяющимися) последовательностями ДНК. Они предназначены для выявления диагностически и прогностически значимых хромосомных аберраций при различных патологических состояниях.

ДНК-зонды к теломерным участкам хромосом - TEL (Telomeric Probe) - предназначены для выявления делеций и перестроек, затрагивающих концевые участки плеч хромосом. Такие зонды специфичны для р- или q- плеч хромосом (p - короткое плечо, q - длинное) и комплементарны участку длиной около 300 тысяч нуклеотидных пар от конца хромосомы. Как правило, ДНК-зонды для коротких и длинных плеч хромосом связаны с разными флуорофорами, что позволяет выявлять на одном препарате оба теломерных участка хромосомы. Чтобы облегчить дифференциальную диагностику делеций и моносомий, предлагают использовать еще и ДНК-зонд к центромерному участку исследуемой хромосомы (CEP), связанный с флуорофором, отличным от флуорофоров теломерных ДНК-зондов.

Особенностью FIHS-метода, принципиально отличающей его от классического цитогенетического анализа, является то, что данный метод применим как для метафазных, так и для интерфазных ядер. На основе интерфазного FISH-анализа происходит интеграция молекулярной цитогенетики с другими методами диагностики. В качестве исходного материала для этого исследования можно использовать не только цитогенетические препараты, но и стандартно окрашенные мазки крови, костного мозга или отпечатки лимфоузлов, а также архивный гистологический материал, хранящийся в виде парафиновых блоков. Комбинация FISH с морфологическими методами исследования позволяет напрямую сравнивать цитогенетические и морфологические особенности клеток.