Как выбрать правильный вектор экспрессии и использовать его в системе E.coli

Time:2017-08-15 оригинал публикации

В биомедицинских и других направлениях исследований наблюдается растущая потребность в рекомбинантных белках.  Чтобы получить рекомбинантный белок кодирующая протеин последовательность  клонируется в вектор экспрессии и далее трансформируется в клетке-хозяине.  Что же такое вектор экспрессии?  Упрощенно, вектор экспрессии – это молекула ДНК, приносящая специфический ген в клетку-хозяина и использующая систему синтеза белков этой клетки для синтеза закодированного этим специфическим геном белка.  Векторы экспрессии включают экспрессию чужеродных генов в клетке-хозяине на высоком уровне. После нескольких лет развития использование векторов экспрессии стало широко применяемой популярной биотехнологией.

В связи со своей функцией вектор экспрессии может  содержать элементы, необходимые для экспрессии генов.  Хорошо известные  элементы включают в себя нормальный или сильный промоутер, правильную инициирующую трансляционную последовательность, такую как рибосомальный связывающий сайт и инициирующий кодон, терминальный кодон, транскрипционная терминальная последовательность.  Дополнительно, для того чтобы облегчить очищение протеина после его продукции, векторы экспрессии обычно имеют метку очищения, которая добавлена к последовательности интересующего протеина. Наконец, некоторые векторы экспрессии имеют определенные элементы,  имеющие решающее значение для процессов трансформации или трансфекции.

Обычно вектор экспрессии более сложный по сравнению с вектором клонирования -  молекула ДНК, которая несет чужеродную ДНК в клетку-хозяина, внутри клетки реплицирует и продуцирует множество копий гена-мишени.  Векторы клонирования содержат элементы, важные для саморепликации, но не имеют элементов, контролирующих экспрессию белков. В сравнение, векторы экспрессии имеют оба эти элемента.

В настоящее время доступен ряд систем экспрессии белков,  таких как E. coli, дрожжи, клетки насекомых, клетки млекопитающих. Соответственно, существует множество различных векторов экспрессии, которые могут использоваться в различных системах экспрессии.   Наиболее часто используемые векторы экспрессии – это плазмиды или вирусы. Какой выбрать вектор экспрессии, зависит от системы экспрессии и множества других факторов.  Подходящий вектор экспрессии усиливает успешную экспрессию белка-мишени и, если это необходимо, очистку белка.  

Выбирая вектор экспрессии, примите во внимание следующие моменты:

Система экспрессии

Необходимо выбрать вектор, соответствующий системе экспрессии  (такой, как дрожжи, E. coli, клетки млекопитающих, насекомых, etc.).

Перед выбором вектора необходимо выбрать систему экспрессии для интересующего протеина.  

Pic. 1 Показан вектор экспрессии pET22b-JT, использующийся в системе экспрессии E. Coli 

Pic. 2 Показан вектор экспрессии pPic9k-JT использующийся в системе экспрессии E. Coli 

Метка очистки 

Если вы хотите очистить белок после экспрессии, вектор экспрессии может содержать метки экспрессии, такие как  His, Myc, FLAG, etc. В дополнение, присутствие  C-terminal или N-terminal зависит от специфических условий эксперимента.

Использование белка

Векторы экспрессии могут содержать другие метки и химерные последовательности, в соответствии с целями последующего использования белка-мишени.   Если необходимо лучше понять функцию белка-мишени, метки и другие последовательности – полезный инструмент, позволяющие в дальнейшем проводить вестерн блот, иммунопреципитацию и другие эксперименты.

Сила промотора

В некоторых случаях необходим сильный промотор, в других – нормальный промотор.  Например, в дрожжах  TEF1 -  сильный структурный промотор, ADH1 структурный промотор средней силы, STE1   - слабый структурный промотор. Идеальный промотор достаточно силен для высокого  накопления продукта внутри клетки-хозяина и может минимизировать такие нежелательные эффекты на рост клетки, как токсичность.

Выбранный маркер

Выбираемый маркер  - это ген, сообщающий  свойство, «пригодное» клетке-хозяину.  Опция выбираемого маркера зависит от того, какая клетка-хозяин используется. Например, бета-лактамаза сообщает бактериальным клеткам-хозяевам резистентность к ампициллину.

Размер вектора

Здесь мы коснемся вопроса – с каким фрагментом ДНК – большим или маленьким – вы будете работать.  Векторы должны быть небольшими молекулами для удобства их использования.  Слишком большие векторы могут повлиять на репликацию и обусловить проблемы со стабильностью.   Обычно плазмиды  имеют последовательность до  15 kb. Но есть некоторые специальные плазмиды, которые содержат бОльшие последовательности. 

Главная цель любой системы экспрессии – продукция рекомбинантного белка высокого качества и в достаточном количестве.  Вектор экспрессии помогает «представить» инородный генетический материал клетке-хозяину, запускает экспрессию гена-мишени в клетке-хозяине и производит очищение белка-мишени. Поэтому выбор подходящего вектора экспрессии так важен.   

Вектор экспрессии системы экспрессии E.coli

В настоящее время доступно множество систем экспрессии белков, такие, как E. coli, дрожии, клетки насекомых, клетки млекопитающих. Соответственно, доступны различные векторы экспрессии, которые могут быть использованы в различных системах экспрессии.  Компания Кусабио предлагает некоторые векторы экспрессии E. coli по выгодной цене:

Expression Vector of E.coli Expression System

Все вопросы по продукции Cusabio вы можете направить на электронную почту info@ld.ru