Стандарт мутности

При проведении различных бактериологических исследований часто возникает необходимость приготовить инокулюм, содержащий определенное количество микробных клеток (вернее сказать - колониеобразующих единиц, КОЕ). Для этого готовят серию последовательных разведений исходной суспензии. Концентрацию клеток в ней оценивают, сравнивая ее мутность с контрольным эталоном.

Первоначально эталон готовили из взвеси Salmonella typhi, инактивированных 2% формалином или прогреванием при 60 ⁰С в течение 1,5 часов и законсервированных добавлением 0,5% фенола. Однако, бактериальные эталоны мутности очень нестабильны при хранении и им на смену пришел стеклянный международный эталон.

Стандарт мутности (син.: международный стандарт мутности, стеклянный стандарт мутности), утвержденный Всемирной организацией здравоохранения первичный эталон мутности для оптической стандартизации бактериальных взвесей, соответствующий мутности взвеси бактерий Борде — Жангу, содержащей 10¹⁰ клеток в 1 мл, т.е. равный 10 единицам мутности; представляет собой взвесь частиц стекла пирекс. В нашей стране такой эталон выпускает Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля биологических препаратов имени Л. А. Тарасевича. Он представляет собой взвешенные в дистиллированной воде частицы стекла «Пирекс» диаметром от 0,5 до 3,5 мкм. Взвесь этого стекла химически устойчива, не коагулирует при седиментации частиц, при взбалтывании осадка образует взвесь исходной дисперсности и мутности. Стандарт состоит из трех запаянных пробирок-эталонов, эквивалентных по степени мутности 5, 10 и 20 международным единицам мутности. Мутность стандарта на 10 единиц соответствует следующей концентрации микроорганизмов:

К комплекту бактериальных эталонов прилагаются шрифтовая таблица, содержащая набор различных шрифтов, и две пустые пробирки, диаметр, толщина стенок и цвет стекла которых точно соответствуют пробиркам-эталонам, так как при сравнении микробной взвеси одной концентрации, содержащейся в пробирках разных диаметров, мутность жидкости будет неодинаковой.

Хотя стеклянный стандарт официально является международным, наиболее широкое распространение в лабораторной практике получил стандарт McFarland на основе хлорида бария. Предложенный Джозефом Макфарландом в 1907 году, этот эталон указан практически во всех  нормативных документах, включая стандарты серий DIN, ISO, EN.

Шкала McFarland охватывает диапазон от 1,0 · 10⁸ КОЕ/мл до 3,0 · 10⁹ КОЕ/мл (0,5 - 10 Ед). Ведущие микробиологические фирмы производят стандарты, наиболее часто применяемые в лабораториях в повседневной работе, однако, при необходимости они легко могут быть изготовлены самостоятельно.

Приготовление стандарта мутности

Для получения наиболее широко используемого стандарта McFarland 0,5 Ед смешивают 0,5 мл 1,175% (вес/объем) взвеси двухводного хлорида бария (BaCl₂·2H₂O) и 99,5 мл 1% (объем/объем) серной кислоты (H₂SO₄). Полученную взвесь разливают по 5-6 мл в пробирки, идентичные тем, в которых будет готовиться взвесь бактерий, и тщательно закрывают пробками, герметизируя их при помощи пленки типа «Parafilm» или другим способом, предупреждающим испарение жидкости. Такой стандарт мутности может храниться до 6 месяцев в темноте при комнатной температуре (22-25⁰С). На пробирки со стандартами необходимо нанести специальные метки, позволяющие контролировать постоянство объема жидкости. Перед применением стандарт мутности необходимо интенсивно встряхнуть для получения равномерной взвеси хлорида бария. Состав различных вариантов стандарта McFarland приведен в таблице

Состав стандарта мутности McFarland

Контроль стандарта мутности

Для быстрого контроля можно использовать спектрофотометр или нефелометр с кюветой 1 см . Определение пропускания или поглощения света позволяет достаточно точно оценить качество приготовленного эталона.

Альтернативным методом контроля является мерный посев на неселективную среду из разведений контрольного штамма (например E.coli)

Вариант № 1

1. Вырастить эталонную культуру на агаре Мюллера-Хинтона в течение 18-24 часов при температуре 37 ⁰С.
2. Приготовить суспензию микроорганизмов в стерильном изотоническом растворе, не допуская образования комков. Уровнять мутность суспензии и стандарта McFarland, добавляя культуру или стерильный физраствор.
3. В стерильные пробирки разлить по 4,5 мл стерильного изотонического раствора. Подписать пробирки ( от № 1 до № 7)
4. Тщательно перемешать исходную суспензию и перенести пипеткой 0,5 мл в пробирку № 7.
5. Тщательно перемешать разведение, 5-10 раз заполняя и опорожняя пипетку. Пипетка при этом все время должна быть погружена в жидкость. Не допускается продувания воздуха через жидкость.
6. Новой пипеткой перенести 0,5 мл из пробирки № 7 в пробирку № 6.
7. Повторить пп. 5 и 6 для получения необходимого количества разведений.
8. Подсушить 4 чашки с агаром Мюллера-Хинтона. Подписать чашки (от № 1 до № 4)
9. Стерильной пипеткой перенести 0,1 мл жидкости из пробирки № 1 в чашку № 1.
10. Той же пипеткой 0,1 мл разведения из пробирки № 2 перенести в чашку № 2, из пробирки № 3 – в чашку № 3, из пробирки № 4 – в чашку № 4.
11. Стерильным стеклянным или металлическим шпателем равномерно распределить жидкость в чашке № 1.
12. Тем же шпателем распределить жидкость последовательно в чашках №№ 2, 3 и 4.
13. Инкубировать чашки при 37 ⁰С 18 – 24 часа
14. Подсчитать количество выросших колоний

Интерпретация полученных результатов основывается на том, что стандарт мутности McFarland 0,5 эквивалентен концентрации микроорганизмов примерно 10⁸ КОЕ/мл. При правильном приготовлении исходной суспензии и десятикратных разведений на чашке № 3 должно вырастать около 300 колоний. В противном случае в расчет принимается результат, полученный на чашке № 2.

Вариант № 2

1. Приготовить исходную суспензию и разведения, как указано в пп. 1-7 варианта № 1.
2. чашки с агаром Мюллера-Хинтона. Подписать чашки от № 1 до № 5
3. При помощи микродозатора на 20 мкл стерильным наконечником нанести 5 капель из пробирки № 1 на чашку № 1. Аккуратным покачиванием распределить капли по поверхности агара, не допуская их слияния.
4. Повторить п. 3. для остальных разведений.
5. После полного впитывания жидкости чашки перевернуть и инкубировать в термостате при 37 ⁰С 18 – 24 часа.
6. Подсчитать количество колоний в каплях.

Стандарты мутности по Мак-Фарланду используются как образцы для приготовления бактериальной суспензии.

Наименование	Объем	Производство	Метод	Кат.Номер
Денситометр DEN-1 Biosan (Адаптер для трубок 18мм 230В, 0,3-15,00McF) BS-050102-AAF		BioSan		6283401
МcFarland денситометр для измерения мутности раствора с адаптером, блок питания 230VAC/12V		BioSan		BS-050102-AAF/AK