Окраска по Граму
Немного истории
Ганс Кристиан Йоахим Грам (дат. Hans Christian Joachim Gram ; 13 сентября 1853 — 14 ноября 1938) — датский бактериолог. Родился в семье Фредерика Теркеля Юлиуса Грама, профессора юриспруденции и Луизы Кристины Рулунд.
Грам изучал ботанику в Университете Копенгагена и был ассистентом ботаники у зоолога Япетуса Стенструпа. Работа с растениями позволила ему узнать основы фармакологии и научиться пользоваться микроскопом. Он поступил в медицинскую школу в 1878 году и закончил её в 1883.
Между 1878 и 1885 годами Грам путешествовал по Европе. В Берлине, в 1884, он разработал метод разделения двух основных классов бактерий. Эта техника, Метод окраски Грама, продолжает оставаться стандартной процедурой в медицинской микробиологии.
Грам был скромным человеком и в своей первой публикации отметил, "И таким образом я публикую метод, несмотря на то, что знаю что сейчас он имеет недостатки и несовершенен; но я также надеюсь что в руках других исследователей он превратится во что-то полезное." В настоящее время известно много модификаций окраски по Граму.
Теория
Окраска по Граму основана на различиях в строении клеточной стенки прокариот. Грамположительные бактерии имеют толстую, прочную, просто устроенную стенку (толщина более 50 нм) Основным компонентом клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин), построенный их остатком N-ацетил мурамовой кислоты. Прочность линейному полимеру придают поперечные тетрапептидные сшивки, соединяющие отдельные слои пептидогликана. С петидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые или липотейхоевые кислоты (от греч. teichos - стенка), молекулы которых представляют собой цепи из 8-50 остатков глицерола и рибитола, соединенных фосфатными мостиками. Молекулы тейхоевых кислот являются рецепторами адгезии (адгезинами), специфическими антигенами многих бактерий. С пептидогликаном могут быть связаны белки (А, М, Т, R и др.), которые располагаются снаружи также кластерами. Эти белки являются антифагинами, репелентами фагоцитоза, рецепторами для антител. Смесь S.aureus и E.coli
Грамотрицательные бактерии содержат очень небольшое количество пептидогликана, не имеющего поперечных сшивок. Над слоем муреина располагается периплазматическое пространство, играющее важную роль в обменных процесса (периплазматические ферменты) Далее располагается наружная мембрана, которая имеет строение, характерное для биологических мембран. Внешний листок наружной мембраны содержит липополисахарид (ЛПС), состоящий из трех компонентов: липида А, стержневой (базисной) части, или ядра, и полисахаридной цепи, образованной повторяющимися олигосахаридными последовательностями.
Основной краситель интенсивно связывается муреиновым слоем. Поскольку этот слой у грамотрицательных бактерий очень тонкий и экранируется внешней мембраной, эти микроорганизмы сорбируют значительно меньше красителя, чем грамположительные.
Йод образует с красителем и муреином сложный комплекс, который труднее вымывается обесцвечивающими растворами. Дифференцирующие растворы вымывают весь краситель из клеточной стенки грамотрицательных бактерий, в то время, как грамположительные еще содержат достаточное количество красителя.
Дополнительный краситель докрашивает обесцвеченные грамотрицательные бактерии в контрасный цвет.
Варианты окраски
"Классический" метод
Красители и реактивы
- Основной краситель
- Протравливающий раствор
- Обесцвечивающий раствор
- Дополнительный краситель
Методика окраски
- На фиксированный мазок положить кусочек фильтровальной бумаги и нанести с избытком основной краситель (1-2 мин)
- Слить краситель, промыть препарат водой, нанести раствор Люголя. (1-2 мин)
- Слить раствор Люголя, препарат поместить в спирт (или налить спирт на препарат). (30-60 сек)
- Тщательно промыть дистиллированной водой.
- Докрасить одним из дополнительных красителей. (1-2 мин)
- Промыть и подсушить препарат
Модификация Hucker
Красители и реактивы
- Основной краситель
- Протравливающий раствор
- Обесцвечивающий раствор
- Дополнительный краситель
Методика окраски
- На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин)
- Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек)
- Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин)
- Промыть водопроводной водой и тщательно высушить
- Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить
- Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек)
- Промыть и подсушить препарат
Модификация Burke
Красители и реактивы
- Основной краситель
- Протравливающий раствор
- Обесцвечивающий раствор
- Дополнительный краситель
Методика окраски
- Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют
- Окраска основным красителем. На мазок наливают раствор а и добавляют 2-3 капли раствора b. (2-3 мин)
- Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более)
- Промыть водопроводной водой и осторожно удалить избыток воды фильтровальной бумагой (не сушить)
- Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек)
- Препарат высушить на воздухе.
- Докрасить дополнительным красителем. (5-10 сек)
- Промыть и подсушить препарат
Модификация Kopeloff-Beerman
Красители и реактивы
- Основной краситель
- Протравливающий раствор
- Обесцвечивающий раствор
- Дополнительный краситель
Методика окраски
- Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют
- Окраска основным красителем. Растворы а и b смешивают в соотношении 15:4. Наносят на мазок (5 мин и более)
- Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более)
- Стряхнуть избыток раствора Люголя. Не промывать
- Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек)
- Препарат высушить на воздухе.
- Докрасить дополнительным красителем. (1-2 мин)
- Промыть и подсушить препарат
Модификация Синева
Красители и реактивы
- Основной краситель
- Протравливающий раствор
- Обесцвечивающий раствор
- Дополнительный краситель
Методика окраски
- На фиксированный мазок наложить фильтровальную бумагу с основным красителем. Нанести сверху несколько капель воды (1 мин)
- Стряхнуть основной краситель. Налить на препарат раствор Люголя. (1 мин)
- Стряхнуть раствор Люголя. Не промывать
- Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая (или нанести спирт на мазок).
- Тщательно промыть дистиллированной водой.
- На препарат положить фильтровальную бумагу с дополнительным красителем. Нанести несколько капель воды.(1 мин)
- Промыть и подсушить препарат
Модификация Preston-Morrell (требует редакции)
Красители и реактивы
- Основной краситель
- Протравливающий раствор
- Обесцвечивающий раствор
- Дополнительный краситель
Методика окраски
- На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин)
- Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек)
- Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин)
- Промыть водопроводной водой и тщательно высушить
- Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить
- Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек)
- Промыть и подсушить препарат
Ошибки
Грамположительные бактерии окрасились в красный цвет
| Причина | Решение |
|---|
|
Мазок переобесцвечен (самая частая ошибка)
|
- Приготовить новый мазок и повторить окраску, уменьшив время обработки обесцвечивающим раствором
- Просмотреть много полей зрения в испорченном мазке. Иногда удается найти подходящие
- Если нет возможности приготовить новый мазок, полностью обесцветить имеющийся, тщательно промыть водой, высушить и повторить окраску
|
| Старая культура |
Окраска по Граму учитывается для суточных культур (для медленно растущих бактерий - через двое-трое суток). При длительном хранении на питательной среде наблюдается дегенарация муреинового слоя. Используйте культуру подходящего возраста |
| Культура выращена в неблагоприятных условиях |
При выращивании на селективных средах может образовываться слишком тонкий муреиновый слой Культивируйте микроорганизм на полноценной среде |
| Особенности строения клеточной стенки (грамвариабельные бактерии) |
нет |
Грамотрицательные бактерии окрасились в синий цвет
| Причина | Решение |
|---|
|
Слишком густой мазок или наличие конгломератов (например, при аутоагглютинации)
|
Краситель удерживается не клеточной стенкой, а за счет капиллярности пространств между клетками в скоплении
- Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальной \"густотой\" мазка
- Повторить приготовление препарата, взяв меньше культуры и приготовив мазок на большей площади
- При аутоагглютинации культуры взять для приготовления мазка дистиллированную воду
|
|
Мазок плохо обесцвечен
|
- Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальным обесцвечиванием
- Повторить приготовление препарата и его окраску
- Дообесцветить имеющийся мазок
- Проверить правильность приготовления обесцвечивающего раствора. При повторении ошибки - заменить раствор.
|
|
Особенности строения клеточной стенки (грамвариабельные бактерии)
|
нет
|
|
