Красители и зонды используемые в наборах для ПЦР в реальном времени

Низкоспецифичная детекция результатов ПЦР в реальном времени с помощью интеркалирующих красителей

• SYBR Green PCR Kits (Puda)

• Наборы для анализа сигнальных каскадов методом ОТ-кПЦР от AnyGenes (SignArays)

Детекция продуктов амплификации возможна за счет увеличения флуоресценции интеркалирующего красителя при образовании комплекса с двуцепочечной ДНК.

Самый популярный краситель на сегодняшний день - SYBR Green I. Это чувствительный флуоресцентный индикатор двухцепочечной ДНК.

Максимум флуоресценции в комплексе с ДНК составляет 521 нм, максимум возбуждения - 497 нм (второй максимум около 254 нм). Хорошо возбуждается стандартным 488-нм лазером.

Квантовый выход флуоресценции - около 0.8 (что в 5 раз превышает квантовый выход комплекса этидий-ДНК).

Реже применяются красители EVA Green, LCGreen, Cyto9.

Низкая специфичность детекции результатов ПЦР-РВ при использовании интеркалирующих красителей обусловлена тем, что флуореcценция вызывается накоплением любой двуцепочечной ДНК в реакционной смеси, в том числе и неспецифической!

Следовательно, остается вероятность регистрации ложноположительного результата.

ПЦР в реальном времени c использованием специфичных зондов

• Probe PCR Kits (Puda)

• Набор для детекции генов-маркеров МПН (JAK2, CALR, MPL) методом кПЦР / Pan MPN qPCR Panel (MEDx) 

Более высокой специфичности детекции результатов ПЦР в режиме реального времени можно достигнуть за счет наличия в реакционной смеси дополнительного олигонуклеотида - гибридизационного зонда.

Такой зонд "отжигается" (комплементарно соединяется с ДНК) на участке ампликона меджу прямым и обратным праймером. На разных концах зонда расположены флуорофор и тушитель флуоресценции этого красителя.

Когда флуорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия.

В процессе амплификации за счет 5`-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем и генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению ампликонов.

Таким образом, в случае если используемые праймеры "отожгутся" на неспецифических участках с образованием в ходе ПЦР "нецелевого" продукта, то его последовательность не будет иметь участок, комплементарный гибридизационному зонду и, соответственно, "нецелевые" ампликоны не будут регистрироваться как целевые.

При этом, для такого варианта ПЦР можно одновременно использовать несколько видов красителей и гасителей флуоресценции (с неперекрывающими спектрами излучения).

Это позволяет осуществлять мультиплексную ПЦР.