Метод ПЦР

Суть метода ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR – polymerase chain reaction) – метод получения множества копий определенных фрагментов ДНК (генов) в биологическом образце.

Сущность ПЦР как метода молекулярной биологии заключается в многократном избирательном копировании определённого гена (участка ДНК) при помощи специальных ферментов в условиях in vitro. Важной особенностью ПЦР является получение копий конкретного участка ДНК (гена), соответствующего заданным условиям. Синонимом процесса копирования ДНК является «амплификация». Репликация ДНК in vivo также может считаться амплификацией. Однако в отличие от репликации, в процессе полимеразной цепной реакции амплифицируются короткие участки ДНК (максимум 40 000 пар нуклеотидов).

Основные принципы

Итак, ПЦР - это многократное копирование определенных фрагментов ДНК in vitro в процессе повторяющихся температурных циклов. Как же протекает процесс реакции в пределах одного температурного цикла?

Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой. Однако для начала работы ферменту необходима стартовая площадка. В качестве площадок выступают "праймеры" (затравки) - синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 нуклеотидов. Праймеров должно быть два (прямой и обратный), они комплементарны участкам ДНК-матрицы и именно фрагмент ДНК, ограниченный праймерами, будет многократно копироваться ДНК-полимеразой. Работа полимеразы заключается в последовательном добавлении нуклеотидов, комплементарных последовательности ДНК-матрицы. Тем самым в одном температурном цикле вновь синтезируется два новых фрагмента ДНК (т.к. молекула ДНК - двуцепочечная, то и матриц изначально две). Таким образом, за 25-35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий участка ДНК, определенного праймерами. Структуру отдельного цикла можно представить следующим образом:

1. денатурация ДНК (плавление, расхождение цепей ДНК) - 95°С - 1 или 2 минуты;
2. отжиг праймеров (затравки связываются с ДНК-матрицей, температура данной стадии определяется нуклеотидным составом праймера) - 60°С (к примеру) - 1 минута;
3. элонгация ДНК (полимераза синтезирует цепь ДНК) - 72°С - 1 минута (время зависит от длины синтезируемого фрагмента).

Приборная база для применения метода полимеразной цепной реакции в лаборатории должна состоять из:

1. амплификатора(или, как его еще называют, термоциклера);
2. системы для гель-электрофореза с источником питания (для визуализации результатов ПЦР);
3. системы гель-документации(для анализа результатов ПЦР);
4. ПЦР-бокса(для пробоподготовки);
5. вортекса;
6. микроцентрифуги;
7. набора автоматических дозаторов (механических или электронных).

Помимо основного и вспомогательного оборудования для полноценного функционирования ПЦР-лаборатории, необходимы некоторые расходные материалы: стерильные наконечники, пробирки, штативы для пробирок и дозаторов.

Реагентная база в обычной ПЦР-лаборатории для проведения полноценной полимеразной цепной реакции включает в себя фермент ДНК-полимеразу с буфером, праймеры (небольшие синтетические фрагменты ДНК, комплементарные началу и концу анализируемого участка ДНК-матрицы), смесь нуклеотидов (А, Т, Г, Ц). Также абсолютно необходима очищенная вода.

Достоинства метода ПЦР

Высокая чувствительность исследования

Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 10⁵ клеток.

Специфичность анализа

ПЦР позволяет выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина, а также проводить генотипирование. Специфически подбирая компоненты реакции (праймеры), Вы можете одновременно выявлять ДНК близкородственных микроорганизмов.

Универсальность метода ПЦР

Дело в том, что для ПЦР-диагностики инфекционных заболеваний, либо наследственных заболеваний человека можно использовать одно и то же оборудование, следовать универсальным процедурам подготовки образцов (проб) и постановки анализа, а также однотипные наборы реактивов.

Экономия времени

Важное преимущество ПЦР – отсутствие стадий культуральной микробиологической работы. Подготовка образцов, проведение реакции и анализ результатов максимально облегчен и во многом автоматизирован. Благодаря этому, время получения результата может сокращаться до 4-5 часов.

Эффективность метода ПЦР

ПЦР помогает избежать известных сложностей, возникающих при выращивании труднокультивируемых, некультивируемых или персистирующих форм микроорганизмов для диагностики латентных и хронических инфекций. Эффективен метод ПЦР и при скрининге возбудителей с высокой антигенной изменчивостью, а также внутриклеточных паразитов.

Широта исследуемого клинического материала

В качестве образца при полимеразной цепной реакции может быть использован не только биологический материал от больного, но также и многие другие субстраты, в которых могут быть идентифицированы молекулы ДНК с высокой чувствительностью, например, вода, почва, продукты питания, микроорганизмы, смывы и многое другое.

Все перечисленные выше достоинства этого уникального метода - высокая чувствительность и специфичность, идентификация инфекционного агента и проведение генотипирования любого гена человека, высокая эффективность и экономия времени, универсальность приборной базы – позволяют широко применять сегодня метод ПЦР в клинической диагностике, медицинской практике, научных исследованиях, контроле качества и многих других областях.

 Применение ПЦР

Области применения полимеразной цепной реакции как современного метода молекулярной биологии разнообразны. Во многом это обусловлено широтой материала, который можно анализировать (практически все, из чего можно выделить более-менее качественую ДНК может стать объектом исследования), а также подобранных праймеров. Основные области применения ПЦР:

клиническая медицина

• диагностика инфекционных заболеваний
• диагностика наследственных заболеваний
• выявление мутаций
• генотипирование
• клеточные технологии
• создание генетических паспортов

экология

• мониторинг состояния окружающей среды
• анализ продуктов питания
• анализ генетически-модифицированных организмов (ГМО)

судебная медицина и криминалистика

• идентификация личности
• установление отцовства

фармакология

ветеринария

научные исследования (молекулярная биология, генетика)

Организация лаборатории ПЦР

• Общая информация по организации ПЦР-лабораторий
• Требования к организации помещений для лаборатории ПЦР
• Главная проблема лабораторий ПЦР
• Классическая ПЦР-лаборатория
• ПЦР в модификации FLASH
• Расходные материалы в ПЦР-лаборатории
• Нормативно-правовые документы по ПЦР

Наименование	Объем	Производство	Метод	Кат.Номер
PrecisionShuttle pTUNE Индуцируемый Вектор		OriGene		PS100021
Вода без нуклеаз		---		R0582
Наконечники Vertex до 1250 мкл; с фильтром; бесцветные; градуированные; 96 шт/штатив	96 шт/штатив	SSI		SSI-4347NSFS
Наконечники Vertex на 10 мкл, с фильтром, бесцветные, градуированные, стерильные, 96 шт/штатив		SSI		SSI-4117NSFS
Наконечники Vertex на 10 мкл, с фильтром, удлиненные, бесцветные, градуированные, стерильные, 96 шт/штатив		SSI		SSI-4137NSFS
Наконечники с фильтром стерильные 0,5-10 мкл, Eppendorf-совм., L=4.5 см, 96 шт/упк		---		SSI-4137 NSFS
Ноутбук с предустановленным специализированным программным обеспечением (для ДТ-96, ДТ-322, Джин-4, Джин)		ДНК-Технология	ПЦР в реальном времени	I-PC/01
Пробирка 50 мл, коническая,с дел.,стер.,для ПЦР,п/п,уп.25/кор.500,JET BIOFIL		---		11005548
ПЦР-Буфер-Б для Taq ДНК-полимеразы, 10х, объём 0,5 мл	0,5 мл	Синтол		B-009
Устройство для запечатывания микропланшет"ДТпак"		ДНК-Технология	ПЦР в реальном времени	O-DTPACK