Оборудование для капиллярного секвенированиия и фрагментного анализа
Оборудование для проведения генетического анализа
 Современный капиллярный секвенатор (капиллярный генетический анализатор, секвенатор 1 поколения, классический секвенатор) — автоматический прибор, позволяющий проводить секвенирование и фрагментный анализ нуклеиновых кислот по методу Сэнгера (см. ниже). Разделение фрагментов ДНК сейчас в автоматических капиллярных секвенаторах проводится путем капиллярного электрофореза, ранее это делалось в ручную в плоских гелях с использованием радиоактивной метки.
В капиллярном секвенаторе для анализа используется гомогенная проба (очищенный раствор молекул НК, полученных из одного источника, одинаковой структуры и практически одинаковой длины). Обычно до начала секвенирования производят амплификацию участков ДНК, последовательность которых требуется определить. В результате получается гомогенная проба одинаковых ДНК-фрагментов. Негомогенность исходной пробы, или ошибки в ходе ПЦР-реакции могут привести к тому, что не удастся однозначно определить генетическую структуру молекулы нуклеиновой кислоты.
В отличие от капиллярных секвенаторов в NGS–секвенаторах возможно секвенирование негомогенных проб ("библиотека" молекул НК, которые могут отличаться по длине, по структуре и могут быть получены из различных источников).
Секвенирование ДНК по Сэнгеру — «золотой стандарт» секвенирования, это самый точный метод определения последовательности ДНК на сегодняшний день, который использует относительно дешевые расходные материалы при небольшом потоке образцов. Принцип метода — встраивание терминирующих нуклеотидов (модифицированные трифосфаты, обладающие в 3'-положении водородом вместо гидроксильной группы, поэтому при их включении в ДНК происходит прекращение синтеза цепи) в синтезируемую цепь ДНК. В реакционной смеси находятся ДНК-матрица, праймер, ДНК-полимераза и смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов и их модифицированных аналогов — дидезоксинуклеотидтрифосфатов. В современной версии секвенирования ДНК по Сэнгеру каждый терминирующий трифосфат (ddATP, ddGTP, ddTTP и ddCTP) помечен соответствующим флуоресцентным красителем. Поэтому фрагменты ДНК светятся разным цветом — в зависимости от того, какой терминирующий трифосфат встроился в цепь.
Реакцию проводят циклически (аналогично ПЦР), многократно повторяя синтез новых одноцепочечных фрагментов. Так как ddNTP составляют около 5% от dNTP, в конце такой (линейной) амплификации после 40-50 циклов получается набор одиночных цепей ДНК, отличающихся по длине на 1 нуклеотид и всегда заканчивающихся меченым нуклеотидом.
Разделение фрагментов по длине происходит с помощью капиллярного электрофореза, визуализация результата представляет собой электрофореграмму с цветными пиками. В настоящее время длина секвенируемых таким способом фрагментов достигает 1000 пар нуклеотидов.
Области применения капиллярных секвенаторов: секвенирование геномов de novo, SNP-типирование (онкология, сельскохозяйственная геномика) подтверждение данных NGS-секвенирования, секвенирование микроорганизмов, секвенирование митохондриальной ДНК (анализ родства). Информация для заказа
|
