Капиллярное секвенирование и фрагментный анализ

• Генетический анализатор НАНОФОР 05
• Оборудование для капиллярного секвенированиия и фрагментного анализа
• Расходные материалы и реагенты для капиллярного секвенирования

Капиллярное секвенирование, также известное как секвенирование по Сэнгеру — «золотой стандарт» секвенирования, это самый точный метод определения последовательности ДНК на сегодняшний день, который позволяет использовать доступные по цене расходные материалы при небольшом потоке образцов.

Принцип метода 

В ходе секвенирования по Снгеру происходит встраивание терминирующих нуклеотидов (модифицированные трифосфаты, обладающие в 3'-положении водородом вместо гидроксильной группы, поэтому при их включении в ДНК происходит прекращение синтеза цепи) в синтезируемую цепь ДНК. В реакционной смеси находятся ДНК-матрица, праймер, ДНК-полимераза и смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов и их модифицированных аналогов — дидезоксинуклеотидтрифосфатов. В современной версии секвенирования ДНК по Сэнгеру каждый терминирующий трифосфат (ddATP, ddGTP, ddTTP и ddCTP) помечен соответствующим флуоресцентным красителем. Поэтому фрагменты ДНК светятся разным цветом — в зависимости от того, какой терминирующий трифосфат встроился в цепь.

Реакцию проводят циклически (аналогично ПЦР), многократно повторяя синтез новых одноцепочечных фрагментов. Так как ddNTP составляют около 5% от dNTP, в конце такой (линейной) амплификации после 40-50 циклов получается набор одиночных цепей ДНК, отличающихся по длине на 1 нуклеотид и всегда заканчивающихся меченым нуклеотидом.

Разделение фрагментов по длине происходит с помощью капиллярного электрофореза, визуализация результата представляет собой электрофореграмму с цветными пиками. В настоящее время длина секвенируемых таким способом фрагментов достигает 1200 пар нуклеотидов.

Фрагментный анализ не предполагает определения последовательности ДНК. Этот метод заключается в разделении меченых флуоресцентными красителями ампликонов по размеру путем капиллярного электрофореза и сравнении их со стандартами длин.

Этапы фрагментного анализа:

1. Выделение и очистка ДНК

2. Аплификация выделенной ДНК путем ПЦР, при чем, один праймер из пары является флуоресцентно меченым

3. Подготовка образца перед капиллярным электрофорезом: продукт амплификации смешивается с формамидом и размерным стандартом – набором фрагментов ДНК известной длины, меченых красителем цвета, который не использовали для меченья продуктов. Размерный стандарт служет для картирования исследуемых фрагментов ДНК и определения их длин. 

4. Разделение фрагментов в капиллярном анализаторе.

5. Анализ результатов в специальных программах (определение размера фрагментов, определение генотипов на основании соотношения различных аллелей анализируемых маркеров).

Оборудование для капиллярного секвенирования и фрагментного анализа 

- Капиллярные анализаторы

Генетический анализатор НАНОФОР 05

Вспомогательное оборудование:

- Центрифуги

- Оборудование для электрофореза

- Спектрофотометры и флуориметры

Флуориметр Qubix

Спектрофотометры Miulab 

Расходные материалы для капиллярного и фрагментного анализа

- реагенты для выделения и очистки нуклеиновых кислот

- стандарты длин

- формамид

- линейки капилляров

- полимеры

- буферы

- планшеты